كما عرفنا منذ فترة طويلة ، تعد الطبيعة مصدر إلهام ممتاز للعديد من الدراسات والاكتشافات والتجارب. لقد أظهرت لنا الطيور والحشرات المجنحة أن السماء يمكن تحقيقها تمامًا ، وقد أوضحت لنا الثدييات المائية كيفية إطالة أمد إقامتنا تحت الماء ، وأثبتت العناكب أنه حتى أصغر المخلوقات يمكن أن تخلق شيئًا لا يصدق. في الدراسة التي ندرسها اليوم ، وجد علماء من معهد البحوث الفيزيائية والكيميائية (واكو ، اليابان) طريقة لإنشاء شبكة اصطناعية باستخدام البكتيريا الضوئية. كيف بالضبط حققوا ذلك ، ما مدى طبيعية أنسجة العنكبوت الناتجة ولماذا تم استخدام البكتيريا الضوئية؟ تنتظرنا الإجابات على هذه الأسئلة وغيرها في تقرير العلماء. اذهب.
أساس البحث
بالنسبة للعديد من الناس ، فإن العناكب هي "يا إلهي ، أبعده عني!" أو "آه ، يا له من مقرف." ومع ذلك ، وبغض النظر عن الرهاب والتحيز ضد هذه المخلوقات ، يمكن للمرء أن يفكر في مدى تميز هذه الحيوانات المفترسة ذات الأرجل الثمانية. تم تصميم تشريح العنكبوت حرفيًا من أجل الصيد المثالي. من ناحية ، هناك سم يمكن أن يشل أو حتى يقتل الفريسة أو العدو. من ناحية أخرى ، هناك أعضاء حسية متطورة (خاصة اللمس بسبب داء المشعرات (الشعر) في جميع أنحاء الجسم). إن بطاقة زيارة العناكب ، التي أصبحت أساسًا للعديد من الاستعارات والعبارات ، هي شبكة الإنترنت الخاصة بهم.
فيديو عن كيفية إنتاج العناكب لشبكتها الشهيرة.
الشبكة في جوهرها عبارة عن بروتين ، يكون تكوينه غنيًا بالجليسين (C 2 H 5 NO 2 ) ، والألانين (NH 2 -CH (CH 3 ) -COOH) وسيرين (HO 2 C-CH (NH 2 ) CH 2 OH ). يتكون نسيج العنكبوت في غدة خاصة ، حيث يكون في صورة سائلة.
عندما يتم إفراز الغدة من خلال العديد من أنابيب الغزل ، تشكل ثآليل العنكبوت الخاصة خيوطًا منها ، والتي يستخدمها العنكبوت لبناء مصائده المميتة.
خيوط شبكة العنكبوت فريدة من نوعها لأن خصائصها الميكانيكية تتفوق على العديد من المواد الأخرى. على سبيل المثال ، تبلغ قوة الشد لشبكة العنكبوت لعنكبوت عادي ( Araneus diadematus ) 1.1-2.7 جيجا باسكال ، وشعر الإنسان 0.25 جيجا باسكال ، وللصلب 0.4-1.5 جيجا باسكال. كثافة حرير العنكبوت 1/6 من الفولاذ (1.3 جم / سم 3 ). بمعنى ، إذا كنت تتجول حول الأرض بشبكة ، فسيكون وزنها 500 جرام فقط. كثافة الطاقة حوالي 1.2 × 108 جول / م 3... حرير العنكبوت مرن للغاية أيضًا ، أي يمكن أن تمتد حتى 5 أضعاف طولها الأصلي (في حالة استرخاء) دون أي فواصل. إن قوة تأثير شبكة العنكبوت يمكن مقارنتها بخيوط البولياراميد. العناكب ليست شديدة الحساسية ، لكن شبكاتها يمكنها بسهولة تحمل درجات الحرارة من -40 درجة مئوية إلى 220 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خصائص الحرير القابلة للتحلل الحيوي والمتوافقة معها تجعله مناسبًا للتطبيقات الطبية.
مقارنة قوة الشد للخيط الصلب وحرير العنكبوت (الكثافة المقابلة).
من الغريب أيضًا أن نوعًا واحدًا من العنكبوت يمكنه إنتاج عدة أنواع من الشبكات تختلف في الخصائص والاستخدام (تنتج العناكب من أنواع Argiope argentata ما يصل إلى 5 أنواع مختلفة من الويب):
- للحواف الخارجية وإطار الويب (متين للغاية) ؛
- لمناطق أسر الفريسة (شديدة اللزوجة ، ومرنة ، ودائمة) ؛
- ( );
- ( 2 3 );
- ;
- .
هذا مجرد وصف موجز لحرير العنكبوت ، لكن حتى هذا يكفي لفهم تفرد هذه المادة. هذا هو السبب في أن العديد من العلماء يحاولون لفترة طويلة إنشاء مكافئ اصطناعي للويب. بالنسبة للكثيرين ، هذا ناجح للغاية. ومع ذلك ، لا تزال مشكلة الإنتاج الضخم دون حل.
في العمل الذي ندرسه اليوم ، اقترح العلماء حلاً لهذه المشكلة. وهو يتألف من استخدام البكتيريا الأرجواني رودوفولوم سلفيدوفيلوم ، والتي لها خصائص كل من phototrophs * و halophiles * .
Phototrophs * هي كائنات حية تستخدم الضوء لتوليد الطاقة.
الهالوفيل * هي نوع من الأشخاص الذين يعيشون في ظروف شديدة الملوحة.R.sulfidophilum هي بكتيريا * التمثيل الضوئي غير المؤكسد البحرية ذات الخصائص الأيضية المختلفة التي تنتج الهيدروجين الحيوي والبلاستيك الحيوي والأحماض النووية خارج الخلية.
التمثيل الضوئي غير المؤكسد * - على عكس عملية التمثيل الضوئي العادية ، لا يتشكل الأكسجين الجزيئي أثناء عملية التمثيل الضوئي غير المؤكسدة.ولكن معظم مهارة مهمة من R.sulfidophilum للعلماء هو قدرته على النمو في ظل ظروف ذاتية التغذي ضوئيا من خلال استخدام موارد غير مكلفة والمتجددة مثل الضوء (الطاقة)، CO 2 (مصدر الكربون) وN 2 (مصدر النيتروجين) من خلال عمليات التمثيل الضوئي والتثبيت. نتروجين. بالإضافة إلى ذلك ، يزدهر R.sulfidophilum في مياه البحر ، مما يساعد على تقليل مخاطر التلوث البيولوجي أثناء الزراعة.
في السنوات الأخيرة ، تم تحقيق نتائج جيدة في الإنتاج الضخم للسبيدروين (MaSp ، بروتين حرير العنكبوت) باستخدام الكائنات المضيفة المؤتلفة ( بكتيريا Escherichia coli ، خميرة Pichia pastoris ، دودة القزبومبيكس موري ، التبغ ، مزارع خلايا الثدييات ، إلخ).
لا ينكر مؤلفو هذا العمل نجاح أسلافهم ، لكنهم لاحظوا أحجام الإنتاج الصغيرة للغاية والتكلفة العالية للمنتج النهائي بسبب التكلفة العالية للإنتاج نفسه (في حالة التخمير الميكروبي ، 70٪ من تكاليف الإنتاج عبارة عن مواد خام).
في دراستهم، والكتاب يقترح طريقة جديدة لإنتاج اقتصادا وكفاءة من حرير العنكبوت باستخدام بكتيريا R.sulfidophilum ، قادرة على إنتاج مسعور تكرار تسلسل MaSp1 (spidroin-1) باستخدام كمية صغيرة من المواد العضوية تحت ظروف النمو غيروي التغذي الضوئي أو ذاتي التغذي الضوئي.
نتائج البحث
أولاً كان من الضروري تحضير بكتيريا R.sulfidophilum .
تم الإبلاغ سابقًا عن إمكانية إدخال DNA البلازميد الخارجي في R.sulfidophilum عن طريق الاقتران البكتيري * باستخدام البلازميدات التي تم الحصول عليها من pCF1010 و E. coli S17-1 كسلالة مانحة.
الاقتران * - نقل أحادي الاتجاه لجزء من المادة الوراثية أثناء الاتصال المباشر لخليتين من الخلايا البكتيرية.في هذه الدراسة ، تقرر استخدام ناقل مختلف (pBBR1MCS-2) يحتوي على جين مقاومة الكاناميسين ، وجين الغوغاء الذي يشفر نوكليازًا معينًا ، ومصدر النقل ( oriT * ) ، والتي كانت تستخدم على نطاق واسع في الاقتران البكتيري سالب الجرام.
oriT * هو تسلسل قصير (حتى 500 نقطة أساس) ضروري لنقل الحمض النووي المحتوي عليه من مضيف بكتيري إلى متلقي أثناء الاقتران البكتيري.في كروموسوم R.sulfidophilum (رقم الانضمام NZ_CP015418) ، كان هناك جينات مقاومة تيلوريت ترميز بروتين مقاومة تيلوريت لعائلة TerB في موقع A6W98_RS06280 و A6W98_RS17070.
تم استخدام سمات المقاومة للكاناميسين والتيلوريت كعلامات لاختيار المترافقين الموجبين لـ R. sulfidophilum .
يحتوي Plasmid * pBBR1-Ptrc-MaSp1 على:
- المروج * trc (Ptrc) ، وهو محفز تأسيسي هجين قوي في الإشريكية القولونية ؛
- تسلسل "AGGAGA" لمنطقة ربط الريبوسوم (RBS) ؛
- MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).
* — , .
* — , - ( ).تم الحصول على 0.4 جم تقريبًا من كتلة الخلايا الرطبة (CWM من الكتلة الرطبة للخلية ) من 50 مل من المزرعة المؤتلفة من R. sulfidophilum التي نمت إلى النمو الثابت في ظل ظروف التغذية الضوئية ، أي من مرق البحر (MB من مرق بحري ) مع إضاءة LED عند (730 نانومتر ، 20-30 واط / م 2 ) لمدة 4 أيام.
صورة رقم 1
على الرغم من أن overexpression من البروتينات MaSp1 المؤتلف لم يتم الكشف بوضوح في جميع الثقافات المؤتلف من R. sulfidophilum باستخدام إس دي إس بايج / SDSPAGE ( 1C) ، تم تأكيد التعبير الإيجابي لبروتينات MaSp1 بواسطة طريقة البروتين المناعي لجميع خلايا R.sulfidophilum المؤتلفة التي تحمل pBBR1-Ptrc-MaSp1- (1-mer ، 2-mer ، 3-mer ، أو 6-mer) ( 1d ).
مقاييس K * - تتابعات الطول k الواردة في التسلسل البيولوجي.يحتوي مجال التكرار الوحيد في التركيبات الناتجة على 33 من مخلفات الأحماض الأمينية بالشكل التالي:
NH 2 -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH.
الوزن الجزيئي النظري للبروتينات المستهدفة ، بما في ذلك التسلسلات غير المتسلسلة (مناطق الانقسام في علامة His-Tag و S-Tag و enterokinase والثرومبين) عند الطرف N هو 7.9 كيلو دالتون لـ 1 مير (81 أأ) ؛ 10.5 كيلو دالتون لـ 2 مير (114 أأ) ؛ 13.1 كيلو دالتون لـ 3 مير (147 أأ) و 20.9 كيلو دالتون لـ 6 مير (246 أأ).
نعم - تحديد وحدة الكتلة الذرية ؛ كيلو دالتون - كيلو دالتون (1 كيلو دالتون = 103 دا).بالإضافة إلى تأكيد التعبير عن بروتينات MaSp1 ، تم أيضًا تقييم مقدارها من بروتينات MaSp1 التي تم الحصول عليها من الثقافات المؤتلفة لـ R.sulfidophilum : ~ 3-10 مجم / لتر (1-mer = 3.4 مجم / لتر ؛ 2-mer = 3.9 مجم / لتر ؛ 3-mer = 10.2 مجم / لتر ؛ 6-Mer = 6.8 مجم / لتر) أو 3.5-6.9٪ من إجمالي كمية البروتينات. للمقارنة ، فإن التعبير غير المتجانسة عن spidroins في نظام المؤتلف المشهور والمستخدم على نطاق واسع للإشريكية القولونية قادر على إنتاج ~ 0.3-1.2 مجم / لتر فقط من السبيدروين المنقى.
يشار إلى الأليل السائد بحرف كبير (أ مقابل أ). نظرًا لأن كل والد يوفر أليلًا واحدًا ، فإن المجموعات التالية ممكنة: AA و Aa و aa.
النتيجة الأكثر إثارة للدهشة ، وفقًا للعلماء ، في هذه الدراسة هي عرض مصانع الخلايا الميكروبية استنادًا إلى كائنات التمثيل الضوئي البحرية ، حيث يمكن تطبيق نظام النمو الضوئي باستخدام المواد الخام المتجددة غير الغذائية ومياه البحر كوسيلة للزراعة.
R.sulfidophilum ، الذي يحمل pBBR1-Ptrc-MaSp1- (6-mer) ، تمت تربيته في مياه البحر الاصطناعية (Daigo ASW من مياه البحر الاصطناعية) عند إضاءة بمصابيح LED (730 نانومتر ، 20-30 واط / م 2 ) بملح البيكربونات (1) g / l) كمصدر للكربون غير العضوي وغاز النيتروجين (0.5 لتر / د) كمصدر للنيتروجين. كانت مدة الزراعة 7 أيام ( 2 أ ).
الصورة رقم 2
تم اختيار أكبر وحدة مكونة ، MaSp1- (6-mer) ، لإجراء تجارب لاحقة لأن الوزن الجزيئي العالي لـ MaSp1 سيؤدي إلى قوة شد أعلى لألياف حرير العنكبوت. وقد استخدم بيكربونات الصوديوم لتوريد الكربون غير العضوي بسبب أملاح البيكربونات وأعلى الذوبان وانخفاض تكاليف النقل من CO 2 الغاز .
أجرى باحثون سابقون تجارب لتحديد حالة الإضاءة المطلوبة لنمو خلايا R.sulfidophilum : الشدة (8 و 50 وات / م 2 ) وطول الموجة (730 و 800 و 850 نانومتر). قيمت هذه الدراسة آثار نمو R.sulfidophilum المؤتلفالعديد من العناصر الغذائية الإضافية (مستخلص الخميرة والفيتامينات والحديد والفوسفور) التي تعاني من نقص في وسائط ASW.
انخفضت كتلة الخلايا الجافة (CDM) من 0.90 جم / لتر (مع جميع العناصر الغذائية) إلى 0.66 جم / لتر في حالة عدم وجود خلاصة الخميرة وإلى 0.39 جم / لتر في حالة عدم وجود الفوسفور. كما تم تحديد أن R.sulfidophilum المؤتلف لا يمكن أن ينمو في ASW بدون NaHCO 3 أو غاز N 2 أو الفوسفور ( 2b ؛ ASW + N 2 و ASW + C + N 2 و ASW + C + P و ASW + P + ن 2 ).
CDM (~ 0.4 جم / لتر) في مثل هذه المتغيرات المتوسطة ASW ، على الأرجح ، نشأت من اللقاحات *أو لقاح حتى بعد غسل العينات بـ 2٪ كلوريد الصوديوم. وبالتالي ، فإن مصادر الكربون والنيتروجين والفوسفور مطلوبة لنمو R.sulfidophilum المؤتلف في وسط ASW.
لقاح ميكروبيولوجي * - منتجات بيولوجية تحتوي على مستنبتات حية لكائنات دقيقة مفيدة للنباتات.كما هو متوقع ، زاد نمو الخلايا بشكل ملحوظ من 0.34 ± 0.02 جم / لتر (ASW + C + N 2 ) إلى 0.58 ± 0.08 جم / لتر (زيادة 1.7 مرة) و 0.81 ± 0.02 جم / لتر (زيادة 2.4 مرة) بوجود مستخلص الخميرة (ASW + C + N 2 + YE) والفوسفور (ASW + C + N 2 + P) على التوالي.
تم تحقيق أعلى مستوى من CDM بإضافة مستخلص الخميرة والفوسفور ، مما أعطى 1.04 ± 0.06 جم / لتر (زيادة قدرها 3.1 ضعف).
تمت ملاحظة إنتاجية ~ 0.2 مجم / لتر من البروتين المؤتلف MaSp1 (2 ٪ من إجمالي كمية البروتينات) في ظل ظروف ASW + N 2 و ASW + C + N 2 و ASW + C + P و ASW + P + N 2 ( 2c و 2d). تم دعم إنتاج بروتين MaSp1 من خلال إضافة مستخلص الخميرة ، مما زاد بشكل كبير من إنتاج بروتين MaSp1 من 0.12 ± 0.10 مجم / لتر (ASW + C + N 2 ) إلى 3.93 ± 2.76 مجم / لتر (ASW + C + YE + N 2 ).
أدت إضافة الخميرة أيضًا إلى زيادة نسبة MaSp1 في البروتينات الكلية من 1.2 ± 1.0 إلى 6.9 ± 5.3٪. ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة الفوسفور ، بينما كان له تأثير إيجابي على زيادة CDM ، أثر سلبًا على إنتاج بروتين MaSp1.
مقارنة بـ ASW + C + YE + N 2 في وسط ASW + C + YE + P + N 2 ، انخفض عائد بروتين MaSp1 إلى 2.71 ± 1.09 مجم / لتر ، وانخفضت نسبة MaSp1 في إجمالي البروتينات إلى 3.9 ± 1.6٪.
قد يكمن تفسير هذه الاختلافات في إنتاج البروتين اعتمادًا على وسط الثقافة في وظيفة كل مكون. على سبيل المثال ، يعتبر مستخلص الخميرة في المقام الأول مصدرًا للنيتروجين الذي يعزز التخليق الحيوي للبروتين. وفي الوقت نفسه ، يعد الفوسفور عنصرًا مهمًا من المغذيات الكبيرة وغير المتجانسة في العديد من المركبات الخلوية المهمة ، مما يعزز نمو المنتجين الأساسيين.
للحصول على حرير العنكبوت في شكله المعتاد ، كان من الضروري تنقية MaSp1.
الصورة رقم 3
للحصول على ما يكفي من بروتين MaSp1 لبثق الألياف ، تم إجراء التخمير ( 3 أ ) لإنتاج MaSp1- (6-mer).
بشكل عام ، حجم spidroins يرتبط بشكل إيجابي مع قوة الشد إلى وزن جزيئي محدد. تحتوي البروتينات الأكبر حجمًا على مزيد من التفاعلات بين السلسلة وداخل السلسلة ، والمزيد من التشابكات ، وعدد أقل من عيوب نهاية السلسلة.
تم إجراء تنقية MaSp1- (6-mer) باستخدام كروماتوجرافيا التقارب من خلال علامة هيستيدين ، والتي كانت موجودة عند الطرف N من كاسيت الجين MaSp1 وكروماتوجرافيا الترشيح الهلامي. نتيجة لذلك ، تم الحصول على حوالي 10 ملغ من MaSp1 المنقى (6-mer) ( 3b ) من حوالي 40 جم من CWM.
تم تحضير ألياف الحرير عن طريق ماصات بنسبة 10٪ بالوزن من MaSp1- (6 مقاييس) مذابة في سداسي فلورو أيزوبروبانول (HFIP) في حمام التخثر متبوعًا بالسحب اليدوي بالملقط ( 3 ج)). تم الحصول على أفضل النتائج باستخدام 90٪ 2-بروبانول كحمام للتخثر ، مما تسبب في نزح خفيف نسبيًا للماء ، مما سمح بسحب الخيوط بكفاءة. أظهر التحليل عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني أن قطر الألياف يبلغ 10-20 ميكرومتر وأن السطح مغطى بأخاديد موازية لمحور الألياف. أظهر الفركتوجرافي أن الهيكل الداخلي يتكون من ألياف دقيقة ( ثلاثية الأبعاد و 3 هـ ).
لمعرفة أكثر تفصيلا مع الفروق الدقيقة في الدراسة، أوصي بأن تنظر في تقرير العلماء و مواد إضافية لذلك.
الخاتمة
في هذا العمل ، تحدث العلماء عن الإنشاء الناجح لمصنع صغير لإنتاج بروتين MaSp1. الرائد الرئيسي لهذا الإنتاج هو بكتيريا R.sulfidophilum ، والتي بفضلها كان من الممكن تحقيق تعبير ضوئي متغاير من بروتين شبكة العنكبوت الاصطناعية في ظل ظروف النمو الضوئي.
بعبارة أخرى ، قام العلماء بتعديل البكتيريا وراثيًا لإنتاج حرير العنكبوت ، وبشكل أكثر تحديدًا البروتين MaSp1 ، وهو مكون مهم فيه. بالإضافة إلى التلاعب الجيني ، كان من الضروري أيضًا تهيئة الظروف المثلى لزراعة البكتيريا. كما اتضح ، البيئة المثالية هي مياه البحر الاصطناعية. بالإضافة إلى ذلك ، كان من الضروري استخدام غاز النيتروجين ومستخلص الخميرة كمصادر مغذية. تؤدي هذه المكونات معًا إلى نمو بكتيري فعال وبالتالي إنتاج بروتين شبكة العنكبوت.
من المهم أيضًا أن تكون ألياف شبكة العنكبوت التي تم الحصول عليها من البروتين متشابهة جدًا في التركيب مع الألياف الطبيعية التي تنتجها عناكب أنواع Nephila .
لاحظ العلماء أن طريقتهم في زراعة بروتين حرير العنكبوت يمكن استخدامها في زراعة مواد أخرى أيضًا. في المستقبل ، يخطط مؤلفو الدراسة لتحسين مصنعهم الصغير لزيادة حجم إنتاج البروتين وتحسين الخصائص الجزيئية للمنتج الناتج.
وفقًا للعلماء ، يمكن أن يساهم عملهم في حل العديد من المشكلات: أزمات الطاقة والمياه والغذاء ، مشاكل النفايات الصلبة ، الاحتباس الحراري ، إلخ. والسبب في هذا النطاق الواسع من الاحتمالات هو حقيقة أن مثل هذه المصانع تنتج مواد قابلة للتحلل الحيوي ومتوافقة حيويًا باستخدام عملية الكربون المحايدة.
شكرا لاهتمامكم ، ابقوا فضوليين ولديكم أسبوع عمل جيد يا رفاق. :)
قليلا من الدعاية
أشكركم على البقاء معنا. هل تحب مقالاتنا؟ تريد أن ترى المزيد من المحتوى الممتع؟ ادعمنا من خلال تقديم طلب أو التوصية للأصدقاء ، VPS السحابية للمطورين من 4.99 دولارًا أمريكيًا ، وهو تناظرية فريدة من خوادم مستوى الدخول التي اخترعناها لك: الحقيقة الكاملة حول VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 مراكز) 10 جيجا بايت DDR4 480 جيجا بايت SSD 1 جيجا بايت في الثانية من 19 دولار أو كيفية تقسيم السيرفر بشكل صحيح؟ (تتوفر الخيارات مع RAID1 و RAID10 وما يصل إلى 24 مركزًا وذاكرة DDR4 تصل إلى 40 جيجابايت).
هل Dell R730xd 2x أرخص في مركز بيانات Equinix Tier IV في أمستردام؟ فقط لدينا 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6 جيجا هرتز 14C 64 جيجا بايت DDR4 4x960 جيجا بايت SSD 1 جيجا بايت في الثانية 100 تلفزيون من 199 دولارًا في هولندا!Dell R420 - 2x E5-2430 2.2 جيجا هرتز 6C 128 جيجا بايت DDR3 2x960 جيجا بايت SSD 1 جيجا بايت في الثانية 100 تيرا بايت - من 99 دولارًا! اقرأ عن كيفية بناء البنية التحتية للمبنى. فئة مع خوادم Dell R730xd E5-2650 v4 بتكلفة 9000 يورو مقابل فلس واحد؟