إذا كنت مهتمًا بالبيولوجيا ، خاصةً إذا كنت تدرس هذا الموضوع ، فإن مقالتي حول إعداد وإجراء العمل المخبري لتحديد الجين الغريب جينيًا في الحمض النووي للغذاء سيكون مفيدًا لك.
الجدل الدائر حول الكائنات المعدلة وراثيًا ، وكذلك المناقشات العلمية والأخلاقية المستمرة حول شرعية التدخل البشري في "شؤون الطبيعة / الله" ، سوف تُترك للفلاسفة. نذكر فقط أن الكفاءة المهنية لعالم الأحياء الحديث ، والتقني الحيوي ، والمعلوماتية الحيوية ، وعلم الوراثة لا يمكن تصورها بدون القدرة على البحث ، وإذا لزم الأمر ، تغيير الجينات. في المدرسة ، ولاحقًا في الجامعة ، تتطلب تجارب وتجارب التكنولوجيا الحيوية من التلاميذ والطلاب تحديد مهام واضحة ، وفهم منهجية التجربة ، والقدرة على تحليل البيانات. كل هذا يطور الفضول والثقة ، ويخلق أساسًا لمزيد من استكشاف القضايا والمشاكل المرتبطة بالبحث العلمي. بلدي PLAN-CONSPECTبناءً على 3 اختبارات تم إجراؤها باستخدام كواشف BioRad والمعدات القياسية اللازمة لتحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. ولكن ، بالطبع ، يمكن استخدام أي مجموعات أدوات أخرى للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا. تم تفصيل جميع الفروق الدقيقة للتجربة (البروتوكولات) في الوثائق المصاحبة للكواشف ، لذلك لن أسهب في الحديث عنها بالتفصيل. لذا ، فإن الخطة التفصيلية تحمل اسمين: PLAN - لأنك تحتاج إلى التخطيط الواضح والدقيق لمحتوى الدرس ، و CONSPECT - لأنك بحاجة إلى التفكير مسبقًا في المواد التي يجب تعليم الأطفال عليها وما يجب التركيز عليه من أجل الكشف الكامل عن الغرض من التجربة.
خطة
تم تصميم التجربة لجلستين.
الدرس الأول:
1. التعريف النظري للطلاب بأساسيات استراتيجية تتبع الكائنات المعدلة وراثيًا (أهداف الكشف والتعرف).
2. عزل الحمض النووي من الطعام (يجلب تلميذ أو طالب أي منتج من اختياره).
3. إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل.
الدرس الثاني:
4. هلام الكهربائي والمناقشة.
5. ملاحظات ختامية من المعلم.
نبذة مختصرة
الدرس الأول
1. من أين تأتي الجينات الجديدة والعناصر المساعدة من (15-20 دقيقة)
الكائنات المعدلة وراثيًا هي كائنات لها توليفة غريبة من المواد الجينية التي تم الحصول عليها باستخدام التكنولوجيا الحيوية الحديثة. على سبيل المثال ، باستخدام Ti plasmids ، يمكن أن تكون الجينات الأجنبية وخصائص النباتات المعدلة وراثيًا عبارة عن جينات توفر مقاومة لمبيدات الأعشاب (cp4 ، epsps ، gox) ، أو مقاومة الآفات (البكاء) ، أو الجينات التي تغير جودة المنتج (PG ، Bay TE). للتعبير عن جين غريب في خلية مضيفة ، يلزم وجود عناصر وراثية إضافية:
- المروج - تسلسل نيوكليوتيد يتعرف عليه بوليميراز الحمض النووي الريبي كعلامة لبدء النسخ ؛
- – , - ;
- - – ( ), ;
- – , , .
يحتوي تصميم البلازميد أيضًا على جين البلازميدات الخضراء المحفوظ بدرجة عالية من نظام Photosystem II - وهو جزء من تفاعل الضوء لعملية التمثيل الضوئي لتأكيد استخراج الحمض النووي القابل للحياة وأن النتيجة المعدلة وراثيًا السلبية لا ترتبط بمصفوفة غير قابلة للحياة.
يمكن تحديد الحمض النووي المؤتلف في الطعام بعدة طرق ، كما هو موضح في الشكل 1.
الشكل 1. تحديد الحمض النووي المؤتلف في الغذاء
تعتمد مجموعات الكواشف الجاهزة للاستخدام الأكثر شيوعًا المستخدمة لتحديد منتجات الكائنات المعدلة وراثيًا على تحديد المروج والمنهي. تستخدم BioRad's GMO Investigator Kit PCR و DNA الكهربائي للتحقق من وجود تسلسلين مختلفين للحمض النووي المرتبطين بالكائنات المعدلة وراثيًا: محفز 35S من فيروس فسيفساء القرنبيط ومزيل جين سينسيز nopaline synthase من Agrobacterium tumefaciens. توجد سلاسل الحمض النووي هذه في أكثر من 85٪ من النباتات المعدلة وراثيًا التي يتم تسويقها حول العالم. الجين الجديد الموجود في الحمض النووي للتحكم الإيجابي هو epsps. كعنصر تحكم في سلامة الحمض النووي للنبات المستخرج من الطعام ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جزء من جين البلاستيدات الخضراء في النظام الضوئي والذي هو شائع في معظم النباتات العليا. لذا ، فإن الاختبار يستهدف 3 أهداف: مروج ،المنهي وجزء من جين البلاستيدات الخضراء للنظام الضوئي II ، على التوالي ، في مجموعة من 3 بادئات ، اثنان منها (بادئات المحفز والمُنهي) تم خلطهما. لذلك ، هناك زجاجتان في المجموعة: الأحمر - بادئات معدلة وراثيًا ، تستخدم لتحديد ما إذا كان الطعام يحتوي على كائنات معدلة وراثيًا ، ونظام ضوئي للنباتات الخضراء يستخدم لتحديد ما إذا كان قد تم استخلاص الحمض النووي من المواد النباتية.
بعد الخطاب التمهيدي ، يجب أن يكون الطلاب على دراية ببروتوكول استخراج الحمض النووي و PCR ، وشرح خطوة بخطوة مسار التجربة والتركيز على ميزات العمل مع KIT من جهة تصنيع معينة.
2. عزل الحمض النووي من الطعام (15-20 دقيقة)
اعتمادًا على الوظائف المتاحة ، يمكن تقسيم الأطفال إلى مجموعات من 2-3 أشخاص ، يختار كل منهم منتجًا غذائيًا مهمًا للتحليل. يتم الترحيب بالرقائق أو الفشار ، المحبوبين جدًا من قبل تلاميذ المدارس ، كمواد بحثية ، نظرًا لأن جميع البطاطس والذرة التي تُصنع منها الأطعمة المقرمشة تحمل جينات أجنبية ومن السهل جدًا التعرف على الكائنات المعدلة وراثيًا فيها. أو التوت ، على سبيل المثال ، الفراولة ، العنب البري ، الخبز مع بذور عباد الشمس. ولكن يُنصح بالاتفاق مسبقًا على من سيختبر أي منتج ، لأن مجموعات أدوات عزل الحمض النووي مصممة لمنتجات معينة ، وعلى سبيل المثال ، لا يعني استخدامها في هذه الحالة عزل الحمض النووي عن الدقيق والزيت والتوابل ورقائق الذرة وما إلى ذلك.
في التجارب التي وصفتها ، تم عزل الحمض النووي من العنب البري والخيار وبذور عباد الشمس.
السمات المميزة لهذه الدراسة:
- الوزن المسبق للعينة (1 جم) والطحن الدقيق بمدافع الهاون. الطحن ضروري لتدمير جدران الخلايا الكثيفة إلى حد ما للنباتات (التي لا تمتلكها الخلايا الحيوانية).
- العزل باستخدام مصفوفة InstaGene المتجانسة (على الرغم من إمكانية استخدام المنظف بالطبع) بدون إضافة البروتياز (تدمير البروتينات الخلوية) وبدون ترسيب الحمض النووي بالأملاح ، حيث أن الملح موجود بالفعل في InstaGene.
- لا توجد مادة ماصة في KIT ، وبالتالي ، بدون شطف - من حيث المبدأ ، لا يمكن للأطفال الانتباه إلى ذلك.
لماذا تم استخدام InstaGene Matrix من حيث المبدأ؟ لأن هذه طريقة سريعة إلى حد ما لعزل الحمض النووي - في غضون 15-20 دقيقة ، مما يوفر وقت الفصل بشكل كبير. يقوم InstaGene أيضًا بمخلبات الأيونات ثنائية التكافؤ (على سبيل المثال ، Mg2) ، والتي تعد مطلوبة للأنزيمات التي تدمر الحمض النووي (على سبيل المثال ، DNase).
3. تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل
بعد العزل الناجح للحمض النووي من الطعام بواسطة الأطفال ، وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة ، يتم تحضير مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل لـ 6 أنابيب إيبندورف وفقًا للجدول 1 (10-15 دقيقة).
الرابط
بعد ذلك ينتهي الجزء الأول من التجربة. يضع المعلم الأنابيب في مكبر الصوت بنفسه ويضبط أوضاع التضخيم وفقًا للبروتوكول.
الدرس الثاني
4. الرحلان الكهربائي للهلام والمناقشة (40-45 دقيقة)
يحضر الأطفال جل الاغاروز بنسبة 3٪ في محلول TAE. بينما يستمر الرحلان الكهربائي (200 فولت 20 دقيقة) ، يمكنك مناقشة الخيارات المحتملة للنتائج (الشكل 2). وبعد استلام الصور ناقش الأخطاء المحتملة.
الشكل 2. نتائج الاختبار المحتملة
المرجع
على سبيل المثال ، في مجموعة الأطفال الذين اختبروا الخيار ، لم يلاحظ أي أمبليكون (الشكل 3).
الشكل 3. صورة
هلامية لعينة الرحلان الكهربي (الخيار) ⁕ - عناصر تحكم (- لا تحتوي على كائنات معدلة وراثيًا ، + تحتوي على كائنات معدلة وراثيًا) ؛ عينة اختبار T م - علامة الوزن الجزيئي ؛ PMM - نظام ضوئي II تمهيدي ؛ الكائنات المعدلة وراثيًا عبارة عن مادة أولية للكائنات المعدلة وراثيًا.
مناقشة نتائج عينة واحدة:في هذه الحالة ، لم تتم إضافة أي بادئات إلى خليط التضخيم.
التجربة الثانية هي اختبار الحمض النووي لبذور عباد الشمس (الشكل 4).
الشكل 4. صورة
هلامية للرحلان الكهربائي ، عينة بذور عباد الشمس ⁕ - عناصر تحكم (- لا تحتوي على كائنات معدلة وراثيًا ، + تحتوي على كائنات معدلة وراثيًا) ؛ عينة اختبار T م - علامة الوزن الجزيئي ؛ PMM - نظام ضوئي II تمهيدي ؛ الكائنات المعدلة وراثيًا عبارة عن مادة أولية للكائنات المعدلة وراثيًا.
مناقشة نتائج العينة الثانية:التحكم السلبي (gel pocket 2) ، الذي لا يحتوي جينومه على جينات معدلة ، لا يحتوي على أمبليكون. يشير هذا إلى أن التمهيدي لم يتعرف على مروج 35S وموقع تسلسل NOS المنهي. لوحظ النمط المعاكس مع اكتشاف amplicon لحوالي 200 زوج قاعدي في جيب الهلام السادس (تحكم إيجابي - تحكم معدل وراثيًا). بصريًا ، تم الحصول على منتج تضخيم واحد فقط بطول حوالي 200 نقطة أساس في عنصر التحكم الإيجابي GMO (جيب جل 6) ، لكن نواتج التضخيم للمُحفِّز والمُنهي كانت بنفس الحجم تقريبًا (203 نقطة أساس و 225 نقطة أساس ، على التوالي (BioRad)) ، لذلك يمكننا افتراض وجود منتجي تضخيم في جيب الهلام 6.في معظم الدراسات ، يعتبر محفز 35S و NOS المنهي الأكثر استخدامًا ويمكن استخدامهما للكشف عن الجينات المعدلة في أكثر من 85٪ من الحالات. هذه الطريقة كافية للإجابة على السؤال عما إذا كان المروج و / أو المنهي أعلاه موجودًا ، لكن هذه الطريقة ليست كافية للإجابة على الجينات التي تم إدخالها.
يمكن العثور على الأمبليونات الخاصة بجين البلاستيدات الخضراء في النظام الضوئي الثاني في جميع عينات الطعام الثلاثة (الجيوب 1 ، 3 ، 5) ، سواء تلك التي تحتوي على جينات معدلة وتلك التي لا تحتوي على جينات معدلة. لم تحتوي العينات المدروسة على أمبليكونات NOS المنهي أو معزز 35S (الجيب 4). على الرغم من أن التجربة قد أجريت بنجاح وحصل الطلاب على نتيجة لا لبس فيها ، فإن الصورة ليست واضحة تمامًا ، كما لو كانت غائمة. نظرًا لأن هذه الظاهرة امتدت إلى الهلام بالكامل ، يمكن استنتاج أن التلوث حدث أثناء تحضير محلول TAE 1x. ربما كانت الأواني الزجاجية الملوثة في المختبر.
التجربة الأخيرة هي اختبار العنب البري (الشكل 5).
الشكل 5. الرحلان الكهربائي للصورة الهلامية لعينة عنبية
⁕ - عناصر التحكم (- لا تحتوي على الكائنات المعدلة وراثيًا ، + تحتوي على الكائنات المعدلة وراثيًا) ؛ عينة اختبار T م - علامة الوزن الجزيئي ؛ PMM - نظام ضوئي II تمهيدي ؛ الكائنات المعدلة وراثيًا عبارة عن مادة أولية للكائنات المعدلة وراثيًا.
مناقشة نتائج 3 عينات: بعد تشغيل الجل ، يتم عرض هلام الاغاروز من أعلى إلى أسفل. تحتوي جميع عينات الطعام الثلاثة على أمبليكونات مميزة لجين البلاستيدات الخضراء في النظام الضوئي. يمكن رؤية النطاق في عنصر التحكم السلبي (مع بادئات الكائنات المعدلة وراثيًا) ، نظرًا لأن هذا عنصر تحكم حر وراثيًا ، فهذا غريب جدًا. لم يكن من المتوقع وجود amplicons بحوالي 200 زوج أساسي. نطاق 200 نقطة أساس يظهر أيضًا في عينة الاختبار (العنبية) وفي التحكم الإيجابي. يشير هذا إلى أن التمهيدي تعرف على موقع التسلسل لمروج 35S الخاص بإنهاء NOS.
ولكن لماذا تبين أن اختبار عينة من العنب البري كان إيجابيًا (معدل وراثيًا) ، فقد يكون هذا بسبب حقيقة أن العنب البري هو نوع من النباتات الطبيعية المعدلة وراثيًا.
ربما تكون العينة قيد الدراسة مثالاً على تداخل كائن حي مع كائن حي آخر باستخدام بكتيريا التربة (الورم الورمي). تم تحديد أحد الأمثلة على النقل الطبيعي المعدّل وراثيًا في العنب البري بواسطة تاتيانا ماتفيفا ، دكتوراه في العلوم البيولوجية ، أستاذة في معهد علم الوراثة والتكنولوجيا الحيوية ، كلية البيولوجيا ، جامعة ولاية سانت بطرسبرغ. قامت هي وزملاؤها في المعهد بتجميع فهرس عالمي للنباتات ذات الجينوم المتسلسل بالفعل. من بين 275 نوعًا نباتيًا تمت دراستها ، كان 23 منها عبارة عن جينات طبيعية محورة. يشمل صنف الفول السوداني ، وصنف الجوز ، والجنجل ، وفاكهة الجوافة الاستوائية ، وزهور القرنفل ، والكرز السورينامي ، والتوت البري ، والتوت الأزرق. (ماتفييفا ، 2019).
لذلك ، هناك افتراض بأن العنبية المدروسة هي جين طبيعي متحور.
5. 2
يبدو أن أداء تفاعل البوليميراز المتسلسل أمر بسيط ، ولكن استكشاف الأخطاء وإصلاحها قد يكون أكثر صعوبة إذا لم يتم الحصول على amplicon المطلوب أو في حالة ظهور أجزاء غير محددة. غالبًا ما نتحدث عن الأواني الزجاجية الملوثة في المختبر. لتجنب تلوث الكواشف ونهج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب توخي الحذر عند استخدام أطراف ماصة جديدة لكل عملية سحب. بالإضافة إلى ذلك ، من المنطقي تغيير القفازات كثيرًا أثناء العمل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب دائمًا استخدام أوعية التفاعل الجديدة والمعقمة والمحاليل وتوسيمها بشكل صحيح لتتبع التلوث بوضوح. يمكن أن يكون هناك العديد من الأسباب وراء عدم عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب مراعاة العديد من المعلمات الكيميائية والفيزيائية من أجل نجاح PCR. لسوء الحظ ، غالبًا ما يحدث أنه بعد PCR لا يمكن الحصول على النتائج المرجوة.
نظرًا لأنه يمكن اكتشاف أصغر كميات من الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فمن المهم للغاية تجنب تلوث خلائط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من التجارب السابقة أو "الحمض النووي الأجنبي" من مصادر أخرى.
النتيجة
تهدف الخبرة في اكتشاف الكائنات المعدلة وراثيًا في الغذاء إلى اكتساب مهارات عملية في تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل. على الرغم من حقيقة أن خطة الملخص المقترحة ، مصممة لدرسين ، الفاصل بينهما يوم واحد على الأقل ، ومع ذلك ، يبقى السيناريو النموذجي حسب تقدير المعلم. تم تصميم الأقسام التحليلية في هذه الدراسة لتوجيه المتعلمين خلال عملية اكتشاف وفهم المفاهيم ذات الصلة بالإجراءات وتحليل البيانات في كل مرحلة من مراحل الرحلة. من المأمول أن يجعل هذا النهج (مقارنةً بالمعلم الذي يمنح الطلاب جميع المعلومات الأساسية) الدراسة بأكملها أكثر قابلية للفهم لعدد أكبر من الطلاب. طالما أن المعلم لديه الفرصة للتحقق من التقدم ومستوى فهم كل مجموعة (خلال درسين) ،درجة معينة من الاستقلال ممكن إذا رغبت في ذلك. يتيح هذا النهج لمزيد من المتعلمين اكتساب المهارات المطلوبة على النحو المحدد أعلاه.
قائمة الأدب المستخدم:
- bio-rad ، „www.bio-rad.com ،“ 03 فبراير 2020. [عبر الإنترنت]
- Matveeva T. ، Ottem L. (2019). الانتشار الواسع للتحول الوراثي الطبيعي للنباتات عن طريق الجراثيم. علم الأحياء الجزيئي للنبات ، 101 ، 415-437. DOI: 10.1007 / s11103-019-00913-y